Việc phân tích kết quả qPCR trông giống như một kỹ thuật đơn giản nhưng khi được tối ưu hóa, nó có thể mang lại cho ta một kết quả tuyệt vời.

Tuy nhiên, để có được kết quả nhất quán và phản ánh những gì đang thực sự diễn ra trong mẫu xét nghiệm, việc kiểm soát tốt đóng vai trò quan trọng để có được dữ liệu qPCR chính xác. Một trong những yếu tố quan trọng này là việc phân tích đường chuẩn qPCR (The qPCR Standard Curve), giúp ta kiểm tra tính hiệu quả của primer.

Xêm thêm:<< Realtime-PCR là gì?>>

<< Xét nghiệm PCR là gì? Ứng dụng của PCR trong Công Nghệ Sinh Học>>

1. Tính hiệu quả của Primer (mồi) đóng vai trò quan trọng cho việc phân tích kết quả qPCR chính xác

- Thiết kế và thử nghiệm primer qPCR bằng cách sử dụng một đường chuẩn là điều bắt buộc phải có trước khi thực hiện bất kỳ thí nghiệm qPCR nào. Đảm bảo rằng các giá trị Ct thu được có giá trị và phản ánh thực tế.

- Sau khi nhận được primer mới, ta thường thực hiện chạy qPCR để thu được kết quả mới. Nhưng nếu ta không test primer trước thì có thể sẽ nhận được kết quả sai và mất rất nhiều thời gian.

- Mặc dù đoạn primer đã được thiết kế bằng phần mềm công nghệ sinh học ta vẫn nên chọn một chuỗi đã công bố trước đó. Ngay cả khi đường cong nóng chảy tạo ra một đỉnh đơn đẹp và sạch, điều đó không có nghĩa là oligo có thể sử dụng được. Chúng vẫn có thể không khuếch đại mục tiêu một cách hiệu quả trong quá trình khuếch đại DNA phụ thuộc vào liều lượng.

Do đó, phải luôn kiểm tra primer của mình bằng đường chuẩn qPCR. Đường chuẩn qPCR đảm bảo rằng các đoạn primer liên kết và khuếch đại mục tiêu một cách hiệu quả và chính xác, điều này rất quan trọng.

2. Cách thực hiện đường chuẩn qPCR

(1) Để thực hiện đường chuẩn qPCR, hãy thiết lập các phản ứng qPCR để khuếch đại số lượng khác nhau của cùng một mẫu DNA. Về mặt lý thuyết, primer hiệu quả sẽ tạo ra đường cong tỷ lệ thuận phản ứng theo liều lượng (a proportional dose-response curve)

(3) Để có được một đường chuẩn tốt, lý tưởng nhất là bạn cần ít nhất năm điểm dữ liêu tương ứng với các nồng độ pha loãng từ 5 đến 10 lần.

(4) Sau đó, cần vẽ đồ thị các giá trị Ct thu được trên trục Y và số lượng bản sao log DNA trên mỗi mL trên trục X. Một ví dụ về đường cong chuẩn được trình bày trong (Hình 1).

Hình 1: Một ví dụ về đường chuẩn điển hình của qPCR

(4) Để đánh giá độ ổn định lặp lại, ta có thể thực hiện chạy mẫu ít nhất 3 lần với các độ pha loãng thích hợp cho mỗi phản ứng. Sử dụng nước thay vì DNA làm đối chứng âm để phát hiện các chất gây ô nhiễm trong phản ứng và phân biệt tín hiệu nền.

Ngoài ra, hãy đảm bảo mẫu DNA có chất lượng tốt (DNA nguyên vẹn, nồng độ thích hợp và tỷ lệ 260/280 tốt).

3. Phân tích đường chuẩn

Một số phần mềm qPCR có ứng dụng để phân tích đường chuẩn. Nó tạo ra đường cong và tính toán hiệu suất của phản ứng. Một vài giá trị cần tính toán và đánh giá khi phân tích đường chuẩn:

a. Hiệu suất PCR

Ở điều kiện lý tưởng trong quá trình thực hiện PCR, số lượng phân tử DNA sẽ tăng gấp đôi sau mỗi chu kỳ. Điều này sẽ mang lại hiệu suất 100%, đó là những gì ta đang cố gắng đạt được. Các phản ứng hiếm khi hoàn hảo nên phạm vi hiệu suất có thể chấp nhận được là từ 90 đến 110%. 

Làm thế nào bạn có thể đạt được hiệu suất trên 100%? Điều này có thể xảy ra và thường chỉ ra sự ức chế polymerase. Sự ức chế này sẽ mạnh nhất ở những mẫu được pha loãng ít nhất. Khi mẫu được pha loãng, nồng độ chất ức chế giảm (do pha loãng) và điều này có thể dẫn đến hiệu suất trên 100%.

Nếu bạn thấy hiệu suất trên 100%, hãy thử pha loãng mẫu nhiều hơn hoặc không đưa độ pha loãng cao hơn vào tính toán hiệu suất.

Đối với các giá trị dưới 90%, bạn có thể bị nhiễm chất ức chế hoặc hiệu quả primer kém.

b. Cách tính hiệu suất PCR

Nhiều phần mềm qPCR sẽ tính toán hiệu suất PCR cho bạn, nhưng nếu bạn muốn tự tính toán thì bạn có thể sử dụng phương trình sau:

Để có được hiệu suất phần trăm, chỉ cần nhân số đó với 100.

c. Giá trị R^2:

Giá trị R^2 là hệ số tương quan và cần > 0,99 để mang lại độ tin cậy tốt trong mối tương quan.

Giá trị này cho phép bạn xem liệu có mối quan hệ tuyến tính tốt giữa các giá trị của từng mẫu hay không. Giá trị thấp có thể cho thấy độ pha loãng tuần tự kém. Để tránh điều này, khi thực hiện các độ pha loãng tuần tự, hãy đảm bảo sử dụng pipet một cách chính xác, sử dụng pipet đã được hiệu chuẩn tốt và trộn đều các dung dịch pha loãng.

d. Cách tính giá trị R^2:

Để tính giá trị này theo cách thủ công, vẽ một đồ thị với log của mỗi mẫu pha loãng theo giá trị Ct trung bình. Excel sẽ tính giá trị R^2, đảm bảo “Hiển thị phương trình trên biểu đồ” được chọn trong phần tùy chọn biểu đồ.

e. Độ lệch chuẩn cho giá trị Ct

Việc thực hiện lặp lại giúp giảm sai sót và làm cho giá trị hiệu suất R^2 và PCR đáng tin cậy hơn. Tuy nhiên, bạn sẽ không nhận được các giá trị đáng tin cậy cho những giá trị này nếu bản sao thay đổi quá nhiều.

Để kiểm tra độ tin cậy sao, hãy tính độ lệch chuẩn (SD). Bản sao tốt phải nằm trong khoảng 0,2 đơn vị SD. Nếu không, bạn có thể cần phải làm lại đường chuẩn của mình.

Nếu bạn nhận được dữ liệu tốt từ đường chuẩn qPCR của mình, bạn sẽ dần hài lòng với hiệu quả của primer! Nhưng điều gì sẽ xảy ra nếu dữ liệu đường chuẩn không tốt như vậy?

4. Điều gì sẽ xảy ra nếu primer không hiệu quả?

Điều đáng ngạc nhiên là đường chuẩn qPCR thường không cân đối; mỗi nồng độ DNA cho kết quả giá trị Ct xấp xỉ như nhau. Điều này có nghĩa là mồi không nhận ra mục tiêu một cách hiệu quả.

Nếu điều này xảy ra với bạn, trước tiên, hãy đảm bảo mẫu DNA sạch và không chứa chất gây ô nhiễm. Nếu lớp primer vẫn không khuếch đại hiệu quả thì hãy thiết kế và đặt mua một cặp primer mới.

Trước đây, tôi đã cố gắng khắc phục các loại primer kém hiệu quả để tìm ra các thông số thích hợp (nồng độ primer, nhiệt độ ủ, v.v.). Theo tôi, nó hiếm khi dẫn đến kết quả tốt.

5. Đường chuẩn có thể bị ảnh hưởng bởi nồng độ DNA chuẩn 

Đường chuẩn không đạt có thể không phải do mồi kém hiệu quả. Đường chuẩn có thể không chính xác nếu mục tiêu được thể hiện kém trong mẫu. Lúc này, nên xác minh xem mục tiêu này có được thể hiện trong loại tế bào mà bạn đang nghiên cứu hay không. Nếu mục tiêu thể hiện kém, hãy tăng số lượng DNA được sử dụng để khuếch đại.

Ngoài ra, bạn có thể thực hiện bước tiền khuếch đại để tăng biểu hiện của mục tiêu mà bộ dụng cụ thương mại có sẵn. Bạn cũng có thể thực hiện qPCR trên dung dịch ly giải tế bào thô thay vì mẫu RNA đã được tinh sạch để tránh mất vật liệu. 

6. Ưu điểm của đường chuẩn qPCR

Ngoài việc biết liệu primer có hiệu quả hay không, đường chuẩn còn cho bạn biết giới hạn phát hiện. Điều này có thể giúp bạn xác định lượng DNA thích hợp để sử dụng trong các thí nghiệm tiếp theo. Tại sao lại sử dụng 10 ng cho mỗi phản ứng khi bạn có thể đạt được mức khuếch đại tốt ở mức 1 ng? Bằng cách đó, bạn có thể dành các mẫu DNA quý giá của mình cho nhiều phản ứng qPCR hơn!

Tóm lại, việc thiết lập đường chuẩn qPCR là cần thiết cho đánh giá hiệu quả của primer. Ta cần dành thời gian ngay từ đầu để đảm bảo primer hoạt động hiệu quả có thể tiết kiệm rất nhiều thời gian về lâu dài và cuối cùng dẫn đến kết quả tốt hơn.

Tham khảo:

1. Korenkova V, et al. (2015) Pre-amplification in the context of high-throughput qPCR gene expression experiment. BMC Mol Biol. 16:5.

2. Van Peer G, Mestdagh P, Vandesompele J. (2012) Accurate RT-qPCR gene expression analysis on cell culture lysates. Sci Rep. 2:222.

3. Bitesizebio.com: https://bitesizebio.com/31470/obligate-qpcr-standard-curve/