TỔNG QUAN KỸ THUẬT LAI ĐIỂM NGƯỢC (REVERSE DOT BLOT)

Kỹ thuật Reverse Dot Blot (RDB) là kỹ thuật trong đó các đầu dò đặc hiệu với nhiều đột biến hay đa hình của một gen sẽ được gắn trên màng và lai với gen đã được khuếch đại. RDB là một phương pháp phát hiện đơn giản và nhanh chóng, cho phép sàng lọc nhiều loại đột biến/đa hình trong một phản ứng lai đơn.

Nguyên lý

Màng nylon Biodyne C tích điện âm và các nhóm carboxyl trên màng được hoạt hóa bằng EDC (1-ethyl-3-dimethylamino propyl carbodimide hydrochloride) thành dạng O-acylurea. Các nhóm carboxyl sau khi đã được hoạt hóa có thể phản ứng với bất kì tác nhân nào có trong dung dịch.

Đầu dò được cố định trên màng lai là một đoạn oligo có ái lực mạnh và đặc hiệu với trình tự gen mục tiêu. Chiều dài của chúng phù hợp cho phản ứng lai trong các điều kiện ngặt nghèo, giúp phân biệt ADN với những sai khác rất nhỏ trong trình tự. Đầu dò được gắn thêm nhóm amino acid ở đầu 5’ và được gắn lên những vị trí định sẵn trên màng. O-acylurea khi tiếp xúc với đầu dò sẽ lập tức phản ứng với nhóm amin trên đầu dò oligo thành liên kết amide.

Sản phẩm PCR đánh dấu biotin được lai với probe trên màng. Các thể lai có thể được phát hiện bằng phản ứng của một cơ chất không màu với HRP (horseradish peroxidase) để tạo thành kết tủa có màu.

Ứng dụng

Phương pháp RDB được sử dụng chủ yếu để phát hiện kiểu gen của nhiều loại virus, vi khuẩn gây bệnh như HPV, virus Zika, Bacillus cereus, Clostridium botulinum, Clostridium perfringen, Staphylococcus aureus, phát hiện lao kháng thuốc… Rất nhiều nghiên cứu cũng đã sử dụng RDB để phát hiện một số đột biến trên người như α và β-thalassemia, đột biến thiếu hụt Glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD),…

Sản phẩm đến từ ABT

Hiện tại, kỹ thuật lai RDB cũng đã được ABT áp dụng để sản xuất bộ TopSENSI® HPV GENOTYPE RDB KIT nhằm xác định sự đồng nhiễm của 32 type HPV phổ biến tại việt Nam (Human papillomavirus). Bộ kit có khả năng nhận diện 35 genotype HPV bao gồm:

12 genotype HPV nguy cơ cao: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59.
10 genotype HPV có khả năng nguy cơ cao: 26, 34, 53, 66, 67, 68, 69, 70, 73, 82.
13 genotype HPV nguy cơ thấp: 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 64, 71, 72, 81, 83.

Chi tiết xem thêm tại đây

Thành phần và vai trò của các hóa chất trong bộ kit TopSENSI® HPV GENOTYPE RDB KIT:

RBD1	NaOH	Sử dụng để làm biến tính DNA pH [25-29]. Ở pH kiềm, các nhóm OH- chiếm ưu thế. Chúng loại bỏ các proton tạo ra liên kết hydro khỏi guanin và thymine, do đó phá vỡ các liên kết hydro giữa hai oligonucleotide.
RDB6	RDB2: 0.15 M NaCl và 0.015 M sodium citrate	Tạo môi trường ion phù hợp cho phản ứng lai.
	RBD3: 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS).	Kết tủa trong điều kiện lạnh cần phải dã đông trước khi sử dụng. SDS khiến mạch DNA đơn duỗi ra làm giảm cấu trúc bậc 2 để đoạn gen dễ dàng lai vào mẫu dò.
	Nước cất 2 lần.	Tạo môi trường thích hợp để đoạn gen đích lai với mẫu dò đã được cố định trên màng lai đồng thời rửa trôi các liên kết không đặc hiệu.
RDB4	Streptavidin-HRP	Streptavidin có ái lực cao với phân tử biotin. Streptavidin HRP là một cộng hợp protein streptavidin liên hợp với HRP. HRP là 1 peroxidase enzyme. Tùy thuộc vào cơ chất mà phản ứng giữa enzyme HRP và cơ chất sẽ tạo ra màu sắc khác nhau.
RBD5	Tris-HCl 0,1M pH 9,5 NaCl MgCl2	Là môi trường thích hợp để phản ứng hiện màu diễn ra. Đảm bảo pH thích hợp và cung cấp cofactor Mg+ cho enzyme hoạt động.
TMB		TMB là cơ chất của Streptavidin-HRP. Khi TMB liên kết với Streptavidin-HRP sẽ tạo ra phản ứng màu xanh.