Xét nghiệm PCR là gì? Ứng dụng của PCR trong công nghệ sinh học

1. Xét nghiệm PCR là gì?

Xét nghiệm PCR (Polymerase Chain Reaction) là xét nghiệm dựa trên kỹ thuật phản ứng chuỗi polymerase (viết tắt PCR), một kỹ thuật trong phòng thí nghiệm để tạo ra (khuếch đại) hàng triệu đến hàng tỷ bản sao của một đoạn DNA cụ thể trong thời gian ngắn, sau đó có thể được nghiên cứu chi tiết hơn. Do cần một lượng đáng kể mẫu DNA để phân tích phân tử và di truyền nên việc nghiên cứu các đoạn DNA tách biệt gần như không thể thực hiện được nếu không khuếch đại PCR.

Kỹ thuật PCR được xem là một trong những tiến bộ khoa học quan trọng nhất trong sinh học phân tử, được phát minh vào năm 1985 bởi Kary B. Mullis, người đã được trao giải Nobel Hóa học năm 1993.

Kỹ thuật này cho phép ta tạo thêm nhiều bản sao của một phần DNA mà không cần xảy ra bên trong tế bào, có thể thực hiện trong ống nghiệm. Kỹ thuật này hoạt động như một chiếc máy photocopy.

 

2. Nguyên lý hoạt động của PCR?

Khi thiết lập một phản ứng PCR, ta cần những thành phần sau:

• Đoạn DNA mà ta muốn sao chép 

• Dung dịch đệm (buffer) để chứa DNA: 

Thành phần Tris-HCl pH 8,3, KCl, MgCl2 và Gelatin. Dung dịch đệm có ảnh hưởng mạnh mẽ đến tính đặc hiệu và hiệu suất của phản ứng PCR .

• Primer (mồi): 

Mồi PCR là các đoạn DNA ngắn, chuỗi đơn được thiết kế để bổ sung cho phần đầu và phần cuối của chuỗi mục tiêu sẽ được khuếch đại. Trong PCR, các đoạn mồi quyết định chính xác trình tự DNA nào được sao chép.

• DNA polymerase: 

Enzym được sử dụng thường là loại chịu nhiệt vì PCR cần tới nhiệt. Thông thường, polymerase được lựa chọn là Taq polymerase, có nguồn gốc từ một loại vi khuẩn có thể chịu được và sống được ở những nơi có nhiệt độ rất cao trong tự nhiên.

• Nucleotides: dNTP là hỗn hợp gồm 4 thành phần cần cho sự tổng hợp DNA là dATP, dGTP, dCTP, dTTP.

Hình: Các thành phần cho phản ứng PCR (Nguồn: amoebasisters.com)

 

Một chu trình hoạt động của PCR sẽ trải qua 3 bước: 

Bước 1: Biến tính (Denaturation 95 độ C)

Dùng nhiệt để phá vỡ liên kết hydro giữa hai chuỗi DNA và chuyển nó thành chuỗi DNA đơn. Các chuỗi đơn bây giờ hoạt động như một khuôn mẫu để sản xuất các chuỗi DNA mới.

Bước 2: Bắt cặp (Annealing 40 độ C – 70 độ C)

Hai mạch DNA lúc này đã bị phân tách bởi nhiệt, sẽ được làm nguội đi và được nối lại bởi các primer. Nhiệt độ ở bước này sẽ cho phép các primer gắn với đoạn DNA cụ thể mà ta muốn tạo bản sao.

Bước 3: Kéo dài DNA (DNA Synthesis 72 độ C).

DNA polymerase sẽ bắt đầu chạy trên cả 2 nhánh và nó sẽ sử dụng các DNA nucleotide làm nguyên liệu để khuếch đại (tạo bản sao) DNA.

Ta nên lưu ý là nhiệt độ ở bước này cần một nhiệt độ lý tưởng cho loại DNA polymerase cụ thể mà ta sử dụng.

Video: Nguyên lý hoạt động của PCR (National Human Genome Research Institute)

Sau khi hoàn tất một chu trình này, ta sẽ có 2 phân tử DNA xoắn kép

Lặp lại các bước biến tính, bắt cặp và kéo dài từ 2 phân tử vừa tạo ra ta sẽ có 4 DNA. Quá trình được lặp đi lặp lại nhiều lần để tạo ra hàng triệu đến hàng tỷ bản sao của một đoạn DNA.

Toàn bộ quá trình quay vòng PCR được tự động hóa và có thể hoàn thành chỉ trong vài giờ bởi một máy gọi là máy luân nhiệt, được lập trình để thay đổi nhiệt độ của phản ứng cứ sau vài phút để cho phép biến tính và tổng hợp DNA.

Sau khi phản ứng khuếch đại được hoàn thành trong máy luân nhiệt, một phương pháp gọi là điện di trên gel agarose có thể được sử dụng để kiểm tra số lượng và kích thước của các đoạn DNA được tạo ra

 

Hình: Các dòng máy luân nhiệt PCR phổ biến.

 

3. Ứng dụng của xét nghiệm PCR:

Phương pháp PCR ngày càng được ứng dụng rộng rãi ở nhiều lĩnh vực, nổi bật là chẩn đoán lâm sàng và điều trị các bệnh liên quan đến virus gây bệnh ở người, thú y, thủy sản như HIV, HBV viêm gan B, HCV viêm gan C, HPV ung thư cổ tử cung, WSSV, YHV, EHP, MBV, ASFV dịch tả lợn châu Phi, CDV,... Xét nghiệm có thể cho kết quả định tính và định lượng một cách nhanh chóng và chính xác mà các xét nghiệm truyền thống không thể chẩn đoán được hoặc chẩn đoán không chính xác.

Ngoài ra PCR còn đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu di truyền học:

• Xét nghiệm đột biến bệnh di truyền .

• Giám sát gen trong liệu pháp gen.

• Phát hiện gen gây bệnh ở bố mẹ.

• Được sử dụng như một công cụ trong dấu vân tay di truyền.

• Nhận dạng tội phạm từ hàng triệu người.

• Xét nghiệm quan hệ cha con

• So sánh bộ gen của hai sinh vật trong nghiên cứu bộ gen.

• Trong phân tích phát sinh gen của DNA từ bất kỳ nguồn nào như hóa thạch.

• Phân tích biểu hiện gen.

• Lập bản đồ gen

Trong nghiên cứu dịch tễ học chẩn đoán nấm: PCR giúp hỗ trợ việc xác định sớm các vi sinh vật như  như Arbuscular Mycorrhiza, Pneumocystis jiroveci (gây viêm phổi), Aspergillus spp. (gây giảm bạch cầu), sốt rét,... từ đó tăng cường các nghiên cứu dịch tễ học cũng như chẩn đoán nấm và ký sinh trùng, điều này rất cần thiết để nhận biết mầm bệnh. Các xét nghiệm phân tử hỗ trợ quá trình ra quyết định liên quan đến bệnh nấm và ký sinh trùng bằng cách đánh giá tác động của các vi sinh vật này.

Trong vi sinh học: PCR cho phép quan sát ngay lập tức, thực hiện các xét nghiệm chẩn đoán nhằm phát hiện vi sinh vật như Mycobacteria bệnh lao, nghiên cứu mối quan hệ ký sinh trùng vật chủ, xác định các chuẩn vi khuẩn kháng thuốc,…Điều này có giá trị to lớn đối với sức khỏe cộng đồng, giúp phát hiện sớm và điều trị tối ưu.

 

Một ví dụ về chẩn đoán bệnh gây ra bởi virus COVID-19

Ứng dụng mới nhất và được nhắc đến nhiều trong thời gian gần đây là xét nghiệm PCR trong chẩn đoán bệnh do virus Covid-19 gây ra. Xét nghiệm có độ chính xác cao, thời gian thực hiện được rút ngắn chỉ còn vài giờ đã và đang đóng góp lớn cho y học trong đẩy lùi loại virus gây bệnh nguy hiểm này. Đến nay, kết quả xét nghiệm PCR là kết quả được tin cậy sử dụng duy nhất để kiểm tra một người có dương tính hay âm tính với Covid-19.

Bạn chắc đã nghe tới việc lấy mẫu xét nghiệm từ mũi hay họng bằng que trong một “xét nghiệm PCR” rồi nhỉ. Tuy nhiên cụ thể hơn, xét nghiệm cho loại virus này là loại PCR phiên mã ngược thời gian thực (rRT-PCR). Lý do mà nó có cái tên "phiên mã ngược"  là bởi virus này có RNA là vật chất di truyền thay vì là DNA, và ta sẽ phải dùng tới một loại enzyme có tên reverse transcriptase để đổi RNA sang DNA. Vì vậy, trước khi ta có thể tiến hành các bước PCR thông thường như đã nói ở trên, chúng ta cần đổi các RNA đã được tách và tinh chế sang DNA.

Một primer cụ thể được dùng tới sẽ gắn vào vùng RNA của virus và enzyme reverse transcriptase sẽ được dùng để đổi RNA virus thành cDNA (complementary DNA - DNA bổ sung). Sử dụng các primer cụ thể và Taq DNA Polymerase, cDNA sẽ được sao chép qua các chu trình với các bước tương tự như PCR. Mục tiêu vẫn là có được đủ bản sao cDNA virus để có thể nhận ra xem có virus hay không.

Nếu kết quả dương tính, những primer chọn lọc này sẽ gắn vào cDNA virus và Taq DNA polymerase sẽ tạo ra thêm nhiều bản sao cDNA virus qua mỗi chu trình. 
 

Nguồn tham khảo:

National Human Genome Research Institute: https://www.genome.gov/genetics-glossary/Polymerase-Chain-Reaction 

Amobea sisters:

https://www.youtube.com/watch?v=a5jmdh9AnS4 Byjus:

https://byjus.com/biology/pcr/ 

National Library of Medicine (National Center for Biotechnology Information):

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3768498/