REAL-TIME PCR LÀ GÌ (qPCR)?
1.Real-time PCR là gì?
Real-time PCR hay PCR theo thời gian thực (còn được gọi là qPCR) là một cách để tìm hiểu xem có bao nhiêu đoạn DNA cụ thể có trong một mẫu theo thời gian thực. Điều này cho phép các phần DNA (hoặc axit nucleic) được sàng lọc đồng thời.
Phương pháp này sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang không đặc hiệu hoặc đầu dò DNA đặc hiệu theo trình tự có chứa oligonucleotide phóng huỳnh quang (các đoạn DNA lớn hơn) để phát hiện các sản phẩm PCR khi chúng được tạo ra. Việc có thể nhìn thấy trực tiếp sự hiện diện của một nucleotide cụ thể có thể cho biết liệu một sinh vật cụ thể có hiện diện hay không và có thể làm nổi bật những bất thường về gen cụ thể, chẳng hạn như gen CTFR được biết là nguyên nhân gây ra bệnh Xơ nang.
Định lượng số lượng axit nucleic cụ thể có mặt có thể được thực hiện theo hai cách: định lượng tương đối hoặc định lượng tuyệt đối. Định lượng tuyệt đối cho phép so sánh mẫu với tiêu chuẩn DNA để đo số lượng chính xác các phân tử DNA mục tiêu có mặt. Tuy nhiên, định lượng tương đối sử dụng các gen tham chiếu bên trong (các gen trong chính DNA mẫu) để xác định số lượng của gen mục tiêu có mặt.
2. Real-time PCR thường được sử dụng ở đâu?
Trong các phòng thí nghiệm, phòng nghiên cứu hay bệnh viện, phương pháp real-time PCR được sử dụng để nghiên cứu sự biểu hiện gene, chẩn đoán các bệnh do vi-rút, vi khuẩn, phát hiện các yếu tố di truyền,…
Real-time PCR cũng được sử dụng trong công nghiệp. Ví dụ, nó có thể được sử dụng để phân tích vi sinh vật tạp nhiễm của các sản phẩm hoặc nguyên liệu thô như thực phẩm và thuốc… Phương pháp này cũng có thể được sử dụng để tìm hiểu xem một mặt hàng thực phẩm có chứa GMO (Sinh vật biến đổi gen) hay không, bằng cách tìm kiếm sự hiện diện của một gen chuyển trong DNA của sản phẩm nghi ngờ.
3. Ưu và nhược điểm của Real-time PCR:
Real-time PCR có nhiều ưu điểm như độ nhạy, độ đặc hiệu cao, phát hiện thời gian thực, linh hoạt và tiết kiệm thời gian. Tuy nhiên, nó cũng có những nhược điểm như chi phí, tối ưu hóa, chất lượng mẫu, âm tính giả,…
Ưu điểm của qPCR:
- Độ nhạy cao: qPCR là phương pháp có độ nhạy cao để phát hiện trình tự axit nucleic, với khả năng phát hiện ngay cả một bản sao của trình tự đích.
- Tính đặc hiệu: mồi qPCR có thể được thiết kế để có tính đặc hiệu cao đối với trình tự đích, làm giảm khả năng xảy ra kết quả dương tính giả.
- Giám sát thời gian thực: qPCR cho phép giám sát quá trình khuếch đại theo thời gian thực, cung cấp kết quả nhanh chóng và chính xác mà không cần điện di trên gel.
- Tiết kiệm thời gian: qPCR có thể phân tích được nhiều mẫu trong khoảng thời gian nhất định.
- Ứng dụng rộng rãi: qPCR có thể được sử dụng cho nhiều ứng dụng, bao gồm phân tích biểu hiện gene, chẩn đoán lâm sàng, phát hiện mầm bệnh và kiểm tra an toàn thực phẩm…
Nhược điểm của qPCR:
- Chi phí: qPCR có thể đắt hơn các phương pháp phát hiện khác như phương pháp PCR, do chi phí thuốc thử và thiết bị khá cao.
- Yêu cầu tối ưu hóa: qPCR yêu cầu tối ưu hóa các điều kiện phản ứng, bao gồm thiết kế mồi, nhiệt độ ủ và nồng độ enzyme, chu trình nhiệt, thời gian bắt cặp… có thể tốn nhiều thời gian.
- Chất lượng mẫu: Chất lượng và số lượng của DNA hoặc RNA mẫu có thể ảnh hưởng đến độ chính xác của kết quả qPCR, khiến việc chuẩn bị mẫu trở thành một bước quan trọng.
- Âm tính giả: qPCR có thể tạo ra kết quả âm tính giả nếu trình tự đích không có trong mẫu ở mức có thể phát hiện được hoặc nếu có chất ức chế có trong mẫu cản trở phản ứng.
- Giới hạn đối với DNA và RNA: qPCR chỉ phát hiện, định lượng trình tự DNA, RNA và không thể được sử dụng cho các loại phân tử khác.
4. Các bước của Real-time PCR
Bước đầu tiên trong phản ứng real-time PCR là chuyển đổi RNA thành DNA bổ sung (cDNA) – quá trình này được gọi là phiên mã ngược
Bước tiếp theo sử dụng các chất huỳnh quang và phản ứng PCR để khuếch đại và phát hiện các gen cụ thể.
Hai thành phần phát tín hiệu huỳnh quang thường được sử dụng trong phản ứng Real-time PCR là: SYBR green và Taqman probe
- SYBR green: là chất phát huỳnh quang gắn vào sợi đôi DNA. Ở bước bắt cặp, mồi xuôi và mồi ngược sẽ bắt cặp vào trình tự đứt. Enzym DNA polymerase kéo dài tổng hợp mạch mới, chất phát huỳnh quang gắn vào sợi đôi DNA. Khi nó liên kết với DNA, phức hợp thuốc nhuộm DNA thu được sẽ hấp thụ ánh sáng xanh lam và phát ra ánh sáng xanh lục cực mạnh. Nó xảy ra do sự thay đổi cấu trúc trong phân tử thuốc nhuộm khi liên kết với DNA sợi đôi. Tín hiệu huỳnh quang phát ra sẽ được camera ghi nhận lại.
Phương pháp này rất nhạy, chi phí thấp và dễ sử dụng. Tuy nhiên, do khả năng liên kết với bất kỳ DNA sợi đôi nào, liên kết không đặc hiệu có thể dẫn đến định lượng quá mức sản phẩm PCR.
- Taqman probe (mẫu dò đặc hiệu có gắn với chất phát huỳnh quang) là một đoạn oligo nucleotic đặc hiệu với vùng trình tự đích có hai đầu: đầu 5’ reporter (đầu phát huỳnh quang) và đầu 3’ quencher (đầu dập huỳnh quang). Khi đầu 5’ reporter ở gần đầu 3’ quencher thì tín hiệu huỳnh quang bị tắt, không được ghi nhận. Enzym DNA polymerase kéo dài tổng hợp mạch mới làm cắt đứt probe giải phóng đầu 5’ reporter và đầu 3’ quencher, tín hiệu huỳnh quang lúc này sẽ được phát ra.
Phương pháp này có thể dùng cho đa dạng gene mục tiêu, tính hiệu quả cao vì các đầu dò phát hiện các sản phẩm khuếch đại cụ thể. Tuy nhiên chi phí cao hơn so với phương pháp SYBR green.
5. Các yếu tố cân nhắc lựa chọn máy real-time PCR phù hợp:
Để lựa chọn máy Real-time PCR phù hợp với nhu cầu, bạn cần xem xét đến một số yếu tố sau:
- Hiệu suất và thông số kỹ thuật: Đánh giá các thông số hiệu suất của máy như Độ chính xác, ổn định nhiệt, Gia giảm nhiệt, Độ đồng nhất nhiệt giữa các giếng. Hãy chú ý đến các kênh dò, độ nhạy và giới hạn phát hiện để đảm bảo nó đáp ứng các yêu cầu thử nghiệm của bạn. Xem xét số lượng mẫu bạn cần xử lý đồng thời và công suất của máy.
- Khả năng tương thích: Đảm bảo rằng máy tương thích với các thí nghiệm và quy trình bạn dự định sử dụng. Kiểm tra xem máy có hỗ trợ các hóa chất cụ thể, thuốc nhuộm huỳnh quang hoặc đầu dò cần thiết cho thí nghiệm của bạn không. Ngoài ra, hãy xem xét dụng cụ, thuốc thử từ các nhà sản xuất khác nhau có tương thích với máy không
- Phân tích dữ liệu và phần mềm: Bên cạnh phần cứng thì phần mềm cũng là 1 tiêu chí nên đưa ra để lựa chọn một dòng máy. Phần mềm nên có những thông tin căn bản, cần thiết để người dùng dễ tiếp cận trong việc thao tác cũng như phân tích kết quả thí nghiệm. Đánh giá phần mềm được cung cấp kèm theo máy. Nó sẽ cung cấp giao diện người dùng trực quan, công cụ phân tích dữ liệu và khả năng xuất dữ liệu ở các định dạng tương thích. Kiểm tra xem phần mềm có cho phép tùy chỉnh các tham số thử nghiệm hay không và liệu phần mềm có cung cấp các tính năng như xác định ngưỡng tự động và phân tích biểu thức chuẩn hóa hay không.
- Hỗ trợ và dịch vụ: Xem xét danh tiếng của nhà sản xuất và các dịch vụ hỗ trợ khách hàng. Hãy tìm một công ty cung cấp dịch vụ hỗ trợ kỹ thuật, đào tạo và bảo trì. Kiểm tra sự sẵn có của phụ tùng thay thế và thời gian bảo hành được cung cấp cho máy.
- Ngân sách: Máy có thể có giá tùy thuộc vào các tính năng và khả năng mà chúng cung cấp. Xác định ngân sách của bạn và xem xét các chi phí dài hạn liên quan đến máy, bao gồm thuốc thử, vật tư tiêu hao và khả năng nâng cấp.
- Đánh giá và tài liệu tham khảo của người dùng: Đọc các đánh giá và tìm kiếm phản hồi từ các nhà nghiên cứu khác, những người đã sử dụng máy. Kinh nghiệm của họ có thể cung cấp thông tin chi tiết về hiệu suất, độ tin cậy và khả năng sử dụng của máy.
- Mở rộng trong tương lai: Xem xét các nhu cầu trong tương lai và tiềm năng mở rộng nghiên cứu của bạn. Nếu bạn dự đoán sẽ tăng thông lượng mẫu hoặc thêm nhiều mục tiêu hơn, hãy đảm bảo rằng máy có tính linh hoạt để đáp ứng các yêu cầu trong tương lai của bạn.
6. Máy Real-time PCR LineGene Mini S 16 giếng hãng Bioer
LineGene Mini là máy Real-time PCR nhỏ gọn phù hợp cho các phòng thí nghiệm, các phòng xét nghiệm, bệnh viện có nhu cầu chạy Real-time PCR với số lượng mẫu nhỏ. Đây sẽ là sự lựa chọn phù hợp với những lý do sau đây:
- Hiệu suất và thông số kỹ thuật:
Đây là dòng máy Real-time PCR thế hệ mới sử dụng công nghệ định lượng huỳnh quang high-sensitivity photomultiplier (PMTs) với độ chính xác và độ đặc hiệu cao. Thiết bị có 2 phiên bản đó là FQD-16B(EA4) có 4 kênh màu và FQD-16B( EA2) có 2 kênh màu.
- Khả năng tương thích: Máy tương thích với hầu hết các hóa chất, chất thử, vật tư tiêu hao trên thị trường mà không cần dùng bộ vật tư, hóa chất riêng của hãng
- Phân tích dữ liệu và phần mềm:
+ Phần mềm hữu hiệu với tất cả các chức năng của real-time PCR. Tích hợp phân tích đỉnh “chảy” – melt-curve analysis, Phân tích đa hình SNPs,…
+ Phân tích định lượng bằng số copy, nồng độ dựa trên đường chuẩn và thuật toán hồi quy.
+ Dữ liệu về mẫu có thể truy xuất và phân tích lại bất kỳ lúc nào.
+ Dễ dàng truy cập dữ liệu thô.
+ Các kiểu báo cáo đa dạng và công cụ phân tích kết quả có thể được in ra trực tiếp hay có thể truy xuất sang dạng văn bản Excel, Powerpoint...
- Hỗ trợ và dịch vụ: Hãng sản xuất Bioer:
Thành lập từ năm 1995, là nhà cung cấp hàng đầu các sản phẩm công nghệ sinh học phân tử tại Trung Quốc và tự hào nhận được giấy chứng nhận đăng ký đầu tiên của hệ thống phát hiện Real-time PCR của Trung Quốc. Sản phẩm đạt tiêu chuẩn chất lượng ISO (9001:2000), Ferrotec Pelitier/ Met/ CE/ RoHS
Công ty TBR tự hào là nhà phân phối độc quyền của hãng Bioer tại Việt Nam, công ty cung cấp dịch vụ hỗ trợ kỹ thuật, đào tạo kỹ thuật viên và dịch vụ bảo trì miễn phí.
- Giá cả cạnh tranh so với thị trường vì TBR là nhà phân phối trực tiếp và độc quyền của hãng tại Việt Nam,
- Được nhiều khách hàng tin tưởng lựa chọn, đánh giá cao về chất lượng của máy và sự tận tâm của đội ngũ hỗ trợ kỹ thuật TBR.
Xem thêm sản phẩm ở đây: http://www.tbr.vn/vi/product/109-may-realtime-pcr-linegene-mini-s-bioer-fqd16b-ea4-fqd16b-ea2.html
Nguồn: Tổng hợp
