Ở bài viết trước, TBR đã chia sẽ các kiến thức tổng quan về PCR và Real-time PCR. Để một xét nghiệm PCR thành công, cần có rất nhiều yếu tố phải được đảm bảo. Trong đó, chất lượng của DNA thu nhận sau khi tách chiết là một trong những yếu tố quan trọng nhất quyết định sự thành công của xét nghiệm và để đánh giá xem chất lượng DNA có đảm bảo hay không, hiện nay có ba kỹ thuật phổ biến như sau:

Kỹ thuật đo quang phổ hấp phụ:

Tùy vào cấu trúc của các phân tử mà chúng có một đỉnh hấp thụ cực đại nhất định. Các phân tử DNA/RNA do sự tương tác giữa các proton và các electron của vòng purine và pyrimidine mà chúng có khả năng hấp thụ mạnh mẽ ở bước sóng 260nm. Trong khi đó protein có khả năng hấp thụ cực đại tại bước 280nm. Các tạp chất hữu cơ, muối chaotropic hấp thụ mạnh mẽ tại bước sóng 230nm.

                             Phổ hấp thụ của axit nucleic và các tạp chất

 Dựa trên tính chất hấp phụ cực đại của nucleic acid tại bước sóng 260nm, người ta có thể ước lượng được hàm lượng có trong mẫu theo công thức như sau:

Hàm lượng DNA (ng/uL) = 50 x Dilute Factor x OD 260  (áp dụng cho DNA mạch đôi).

Dilute Factor: Hệ số pha loãng.

OD 260: chỉ số đo được ở bước sóng 260.

Để đánh giá độ tinh sạch DNA, các giá trị OD đo tại bước sóng 230nm và 280 cần được thực hiện để phát hiện các tạp chất tồn dư trong mẫu. DNA được đánh giá là tinh sạch khi các tỷ số 260/280 nằm trong khoảng 1.7-2.0 và 260/230 lớn hơn 1.5. Việc nhiễm protein sẽ làm giá trị 260/280 thấp hơn 1.7  trong khi mẫu chứa nhiều muối sẽ có giá trị nhỏ hơn 1.5.

Các lưu ý:

• Vì các DNA và RNA đều có cùng độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 260nm, nên nếu muốn định lượng DNA chính xác, cần loại bỏ các cấu trúc RNA thông qua các enzyme Rnase.
• Các DNA có cấu trúc xoắn kép sẽ hấp thụ UV ít hơn so với DNA xoắn đơn nên cần lưu ý đến hệ số hấp thụ khi tính toán nồng độ.
• Cần chuẩn máy đo quang phổ định kỳ bằng cách đo với các dung dịch DNA đối chứng.
• Độ hấp thụ còn phụ thuộc vào các tác nhân: pH, nhiệt độ.

Ngoài ra, theo kinh nghiệm của TBR các máy quang phổ thường đo với thể tích nhỏ 1-2uL nên để tránh việc sai số, các phép đo nên được lấy giá trị trung bình của  ít nhất 3 lần lặp lại/ mẫu để có kết quả chính xác nhất nhé.

Kỹ thuật đo huỳnh quang

Sự đa dạng của của các thiết bị ghi nhận huỳnh quang và thuốc nhuộm huỳnh quang gắn chèn vào DNA cho phép kỹ thuật đo huỳnh quang trở thành một lựa chọn tối ưu hơn để xác định hiệu suất và nồng độ DNA.

Việc định lượng được thực hiện dựa trên đường cong chuẩn tạo ra từ các mẫu chuẩn có nồng độ đã biết do đó phương pháp này mang lại độ chính xác cao hơn. Mỗi DNA bộ gen, đoạn DNA và plasmid sẽ yêu cầu các đường cong chuẩn riêng và các đường cong chuẩn này không thể được sử dụng thay thế cho nhau. Các giá trị tính toán có thể được xuất ra trực tiếp từ máy mà không cần thông qua các công cụ khác.

Tùy theo loại chất huỳnh quang được sử dụng mà giới hạn phát hiện phát hiện có thể khác nhau, tuy nhiên so với kỹ thuật đo quang phổ hấp thụ, phương pháp này cho phép phát hiện các mẫu DNA ở nồng độ thấp tốt hơn.

Kỹ thuật điện di gel agarose

Nguyên lý của kỹ thuật này dưa trên các đại  phân tử nucleic acid mang điện tích âm khi đặt trong môi trường điện trường, chúng sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dương. Kỹ thuật này cho phép kiểm tra tính toàn vẹn, ước lượng một cách nhanh chóng hàm lượng DNA có trong mẫu.

 DNA bộ gene thu nhận được có chất lượng cao khi có rất ít các vạch smear và band sáng rõ. Ngoài ra do lượng huỳnh quang tỉ lệ với DNA tổng số, nên số lượng DNA có thể ước tính bằng cách so sánh huỳnh quang được tạo ra bởi mẫu chưa biết với một dãy định lượng chuẩn. Trong quá trình chuẩn bị gel, theo kinh nghiệm TBR có thể đặt gel mới đổ ở 4°C trong 20-30 phút để gel mau đông nhé.

Kết quả tách chiết DNA bộ gene từ lá đào sử dụng 3 phương pháp tách chiết, kết quả cho thấy ở phương pháp số 3 cho hiệu suất và độ tinh sạch tốt hơn các phương pháp khác  (band sáng rõ, đậm vạch

Xem thêm: <<Tổng quan về PCR và Real-timePCR>>

                  << Cách ngăn ngừa ngoại nhiễm>>