CÁCH NGĂN NGỪA NGOẠI NHIỄM DNA/RNA

Một trong các ưu điểm vượt trội của kỹ thuật PCR/real-time PCR là độ nhạy của chúng. Từ một vài DNA đích ban đầu, chúng có thể sao chép tạo ra hơn 10 triệu bản sao sau nhiều chu kỳ khuếch đại. Tuy nhiên, nếu chúng ta thiếu cẩn trọng trong quá trình thao tác độ nhạy này đôi lúc cũng gây ra một số vấn đề cho các nhà nghiên cứu. Một trong số những vấn đề mà chúng ta cần lưu ý là ngoại nhiễm nucleic acid (DNA/RNA). Nếu chúng ta kiểm soát không tốt vấn đề này thì có thể dẫn đến những sai lầm trong việc đánh giá kết quả thí nghiệm, hay còn được biết đến là hiện tượng dương tính giả. Trong bài viết dưới đây, chúng tôi sẽ chỉ cho các bạn một số mẹo để ngăn ngừa ngoại nhiễm DNA/RNA.

1) Xây dựng phòng thí nghiệm

Ngăn ngừa ô nhiễm bắt đầu từ việc phân bố các khu vực làm việc trong phòng thí nghiệm. Một phòng thí nghiệm PCR yêu cầu phải có các khu vực như: (1) Khu vực tách chiết và xử lý mẫu; (2) Khu vực pha hóa chất và master mix (phòng sạch) và (3) Khu vực nạp mẫu và máy PCR/real-time PCR

• Trang bị đèn UV ở khu vực làm việc
• Chiếu UV, 15 phút trước và sau khi sử dụng các thiết bị như máy tách chiết, máy PCR/real-time PCR, tủ an toàn sinh học,
• Nên sử dụng kit có sẵn trên thị trường để tách chiết và tinh sạch DNA/RNA.
• Trang bị tủ lạnh/tủ đông chuyên dụng: một tủ để bảo quản kit và một tủ khác để bảo quản mẫu (lưu ý không sử dụng các tủ lạnh gia đình)
• Sử dụng pipet có trục bảo vệ và Filter tip
• Sử dụng nước cất và thuốc thử chuyên dụng cho PCR/real-time PCR

2) Quy tắc làm việc một chiều

Quy trình làm việc của phòng thí nghiệm sinh học phân tử chỉ nên thực hiện theo một chiều, tức là từ khu vực “tiền PCR” (sạch, không có DNA/RNA) và “hậu PCR” (có DNA/RNA).

Master mix và các hóa chất cần thiết cho phản ứng PCR nên được chuẩn bị trong phòng sạch. Quá trình xử lý mẫu và tách chiết nucleic acid cũng nên được thực hiện ở một khu vực riêng. Sau khi quá trình khuếch đại hoàn tất ở phòng nạp mẫu và máy PCR/real-time PCR, chúng ta sẽ thu được một lượng lớn bản sao DNA/RNA nên cần hạn chế mở nắp tube PCR khi không cần thiết và không được phép đưa các sản phẩm PCR ở khu vực này qua các khu vực khác, nguyên nhân là do nucleic acid có thể dễ dàng khuếch tán trong không khí hoặc nhiễm vào các hóa chất, vật tư tiêu hao hoặc thiết bị.

Điều này có nghĩa là các vật tư tiêu hao và PPE (quần áo bảo hộ, kính bảo hộ, găng tay,…) được sử dụng ở khu vực có sản phẩm PCR không bao giờ được trở lại các khu vực khác, đặc biệt là phòng sạch nếu chưa được khử nhiễm kỹ. Khi di chuyển từ phòng này sang phòng khác, kỹ thuật viên phải nhớ thay PPE. Các kỹ thuật viên đã làm việc trong khu vực “hậu PCR” không nên quay lại và làm việc trong khu vực “tiền PCR và phải đảm bảo tuân thủ theo quy trình làm việc một chiều.

3) Thao tác sử dụng pipet

Trong sinh học phân tử, thao tác sử dụng pipet là một yếu tố quan trọng để đảm bảo được hiệu suất và chất lượng kết quả thí nghiệm. Hơn nữa, thao tác pipet chuẩn và chính xác có thể giảm thiểu ngoại nhiễm giữa các mẫu, hạn chế được kết quả dương tính giả. Kỹ thuật pipet thích hợp đảm bảo rằng hút và phân chia chính xác lượng thể tích dung dịch mà mình mong muốn đồng thời tránh dung dịch bắn trong quá trình chia mẫu. Mở, đóng nắp tube PCR và đĩa phản ứng một cách cẩn thận cũng cần thiết để mẫu không văng ra ngoài.

4) Thường xuyên thay găng tay

Kỹ thuật viên phòng thí nghiệm phải luôn đeo găng tay trong suốt quá trình làm việc trong phòng liên quan đến PCR/qPCR. Thay găng tay thường xuyên, đặc biệt nếu bạn nghi ngờ chúng đã bị dính dung dịch chứa DNA mẫu.

5) Kỹ thuật làm sạch vô trùng

Nên thực hiện vệ sinh vô trùng đúng cách nên được thực hiện định kỳ trước và sau khi làm PCR. Điều này áp dụng cho tất cả các bề mặt làm việc bao gồm mặt bàn, pipet, tay cầm tủ lạnh/tủ đông và bất kỳ điểm tiếp xúc nào khác. Chúng tôi khuyên bạn nên lau và ngâm các bề mặt này bằng thuốc tẩy 10-15% (0,5-1% Natri Hypochlorite), được làm mới hằng ngày. Sau 15 phút, sử dụng khăn giấy thấm nước DI để loại dư lượng thuốc tẩy còn sót lại. Sau đó có thể dùng cồn 70% để làm khô nhanh các bề mặt. Một giải pháp khác có thể là sử dụng các bộ hóa chất chuyên dùng để khử nhiễm có sẵn trên thị trường.

6) Các đối chứng đi kèm

Một thí nghiệm thành công phải cần phải sử dụng đối chứng dương để kiểm soát chặt chẽ từ khâu tách chiết DNA/RNA cho đến khi thực hiện PCR/qPCR. Ngoài ra, việc sử dụng thêm đối chứng âm cũng là một yếu tố vô cùng cần thiết, tức là kiểm soát không chứa mẫu. Kiểm soát này dùng để xác minh không có ngoại nhiễm trong hóa chất, vật tư tiêu hao và môi trường

Tài liệu tham khảo

[1]      6 Ways to Minimize Contamination during PCR | labclinics.com.