Tổng quan về qPCR: Hệ thống phát hiện huỳnh quang Real-time PCR

 

1. Hóa chất dùng cho Real-time PCR huỳnh quang:

Hiện nay, có nhiều loại phương pháp Real-time PCR huỳnh quang, nhưng được sử dụng rộng rãi nhất là xét nghiệm 5' nuclease; trong đó nổi tiếng nhất là Xét nghiệm TaqMan® và xét nghiệm dựa trên thuốc nhuộm SYBR® Green (Hình 1).

Hình: Xét nghiệm 5’ nuclease

 

Xét nghiệm 5’ nuclease được đặt tên theo hoạt động liên kết của 5’ nuclease với Taq DNA polymerase

Hình: Minh họa của Taq DNA polymerase. Mỗi màu hình cầu đại diện cho một miền protein.

 

Miền 5`nuclease có khả năng tách liên kết DNA với khuôn mẫu. Yếu tố quan trọng thứ hai trong xét nghiệm 5’ nuclease là một hiện tượng gọi là FRET: truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang. Trong FRET, lượng phát thải của thuốc nhuộm huỳnh quang có thể bị giảm mạnh khi có sự hiện diện của thuốc nhuộm khác trong một khoảng cách rất gần, thường được gọi là ‘quencher’.

Hình: Hiện tượng FRET: (A) FRET xảy ra khi thuốc nhuộm huỳnh quang phát ra ánh sáng màu xanh lá cây ở gần thuốc nhuộm huỳnh quang phát ra ánh sáng đỏ. (B) FRET không xảy ra khi hai thuốc nhuộm huỳnh quang không ở gần nhau

 

FRET có thể được minh họa bằng hai loại thuốc nhuộm huỳnh quang: xanh lá cây và đỏ. Thuốc nhuộm huỳnh quang màu xanh lá cây có năng lượng phát xạ cao hơn so với màu đỏ, vì ánh sáng xanh lá cây có bước sóng ngắn hơn so với màu đỏ. Nếu thuốc nhuộm màu đỏ ở gần thuốc nhuộm màu xanh lá cây, sự kích thích của thuốc nhuộm màu xanh lá cây sẽ làm cho năng lượng phát xạ màu xanh lá cây được chuyển sang thuốc nhuộm màu đỏ. Nói cách khác, năng lượng đang được chuyển từ mức cao hơn xuống mức thấp hơn. Do đó, tín hiệu từ thuốc nhuộm màu xanh lá cây sẽ bị triệt tiêu hoặc “dập tắt”. Tuy nhiên, nếu hai thuốc nhuộm không ở gần nhau thì FRET không thể xảy ra, cho phép thuốc nhuộm màu xanh phát ra toàn bộ tín hiệu của nó.

 

Xét nghiệm 5’ nuclease để phát hiện hoặc định lượng mục tiêu thường có 2 mồi PCR và 1 đầu dò TaqMan

Hình: Đầu dò TaqMan có trình tự gen đặc hiệu và được thiết kế để liên kết mục tiêu giữa hai mồi PCR. Gắn vào đầu 5’ của đầu dò TaqMan gọi là “reporter”, là thuốc nhuộm huỳnh quang sẽ báo cáo mức khuếch đại của mục tiêu. Ở đầu 3’ của đầu dò gọi là “quencher”, giúp dập tắt huỳnh quang từ reporter. Quencher cũng chặn đầu 3’ của đầu dò để nó không thể được mở rộng bằng DNA polymerase chịu nhiệt.

 

Trước khi bắt đầu PCR, đầu dò TaqMan còn nguyên vẹn và có mức độ linh hoạt. Trong khi đầu dò còn nguyên vẹn, reporter và quencher có ái lực tự nhiên với nhau, cho phép xảy ra FRET. Tín hiệu báo cáo bị tắt trước khi PCR.

Hình: Hình minh họa của đầu dò TaqMan trong dung dịch. R là thuốc nhuộm báo cáo, Q là phân tử chất khử và đường màu cam tượng trưng cho oligonucleotide.

 

Trong quá trình PCR, mồi và đầu dò gắn vào mục tiêu. DNA polymerase mở rộng mồi ngược dòng của đầu dò. Nếu đầu dò được liên kết với trình tự mục tiêu chính xác, hoạt động 5’ nuclease của polymerase sẽ tách đầu dò, giải phóng một đoạn chứa thuốc nhuộm reporter. Một khi quá trình phân tách diễn ra, thuốc nhuộm reporter và quencher không còn bị thu hút lẫn nhau nữa; phân tử reporter được giải phóng sẽ không còn bị dập tắt nữa.

 

2. Độ đặc hiệu của xét nghiệm 5’ nuclease:

Độ đặc hiệu của xét nghiệm là mức độ mà xét nghiệm bao gồm tín hiệu từ mục tiêu và loại trừ tín hiệu từ không phải mục tiêu trong kết quả. Tính đặc hiệu được cho là khía cạnh quan trọng nhất của bất kỳ xét nghiệm nào. Mối đe dọa lớn nhất đối với tính đặc hiệu của xét nghiệm với xét nghiệm 5’ nuclease là sự tương đồng. Các gen tương đồng là các gen có trình tự tương tự với gen mục tiêu, nhưng chúng không phải là mục tiêu dự định của xét nghiệm. Tương đồng là cực kỳ phổ biến trong các loài và giữa các loài liên quan.

 

Xét nghiệm 5’ nuclease cung cấp hai công cụ để đánh giá tính đặc hiệu: mồi (primer) và đầu dò (probe). Để có tác động tối đa đến tính đặc hiệu của mồi, sự không phù hợp giữa mục tiêu và chất tương đồng phải được đặt ở đáy lớn nhất 3’ của mồi. Sự không khớp ở xa đầu 3' có thể ít hoặc không ảnh hưởng đến tính đặc hiệu. Ngược lại, sự không khớp trên hầu hết chiều dài của đầu dò MGB, ngắn hơn đầu dò TaqMan, có thể tác động mạnh đến độ đặc hiệu - đầu dò TaqMan MGB là công cụ mạnh hơn về độ đặc hiệu so với mồi.

 

Ví dụ, một hoặc hai sự không khớp ngẫu nhiên của ba zơ ở vị trí liên kết mồi sẽ có thể cho phép DNA polymerase mở rộng mồi liên kết với chất tương đồng, hiệu quả cao. Việc mở rộng một hoặc hai bazơ bằng DNA polymerase sẽ ổn định mồi liên kết với chất tương đồng, do đó, nó liên kết ổn định như mồi liên kết với mục tiêu đã dự định. Tại thời điểm đó, không có gì có thể ngăn cản DNA polymerase tiếp tục tổng hợp để tạo ra một bản sao tương đồng. 

Ngược lại, sự không khớp ở đầu 5’ của vị trí liên kết đầu dò TaqMan không thể được ổn định bằng DNA polymerase do khối quencher ở đầu 3’. Sự không khớp trong vị trí liên kết đầu dò TaqMan MGB sẽ làm giảm mức độ liên kết chặt chẽ của đầu dò, do đó, thay vì phân tách, đầu dò nguyên vẹn sẽ bị dịch chuyển. Đầu dò nguyên vẹn sẽ trở về cấu hình đã tắt của nó, vì vậykhi dữ liệu được thu thập vào cuối chu kỳ PCR, tín hiệu được tạo ra từ mục tiêu chứ không phải tín hiệu tương đồng, mặc dù tín hiệu tương đồng đang được khuếch đại.

Ngoài các chất tương đồng, PCR cũng có thể khuếch đại các sản phẩm không đặc hiệu, được tạo ra bởi các mồi liên kết với các vị trí dường như ngẫu nhiên trong DNA mẫu hoặc đôi khi với chính chúng trong cái gọi là “primer-dimers”. Vì các sản phẩm không đặc hiệu không liên quan đến mục tiêu nên chúng không có vị trí liên kết đầu dò TaqMan và do đó không được nhìn thấy trong dữ liệu PCR thời gian thực.

 

3. Các loại đầu dò TaqMan:

Đầu dò TaqMan có thể được chia thành hai loại: MGB và không MGB. Đầu dò TaqMan đầu tiên có thể được phân loại là “không phải MGB”. Họ sử dụng thuốc nhuộm có tên là thuốc nhuộm TAMRA làm chất khử màu. Trong giai đoạn đầu phát triển PCR thời gian thực, thử nghiệm mở rộng cho thấy đầu dò TaqMan yêu cầu nhiệt độ ủ cao hơn đáng kể so với nhiệt độ mồi PCR để cho phép quá trình phân tách diễn ra. Do đó, đầu dò TaqMan dài hơn mồi. Sự không khớp một bazơ trong các đầu dò dài như vậy có tác động tương đối nhẹ đến sự liên kết của đầu dò, cho phép xảy ra sự phân tách. Tuy nhiên, đối với nhiều ứng dụng liên quan đến độ phức tạp di truyền cao, chẳng hạn như biểu hiện gen nhân chuẩn và SNP, mức độ đặc hiệu cao hơn là mong muốn.

Đầu dò TaqMan MGB là sự cải tiến sau này của công nghệ đầu dò TaqMan. Đầu dò TaqMan MGB có phân tử liên kết rãnh nhỏ (MGB) ở đầu 3’. Khi đầu dò liên kết với mục tiêu, một rãnh nhỏ ngắn được hình thành trong DNA, cho phép phân tử MGB liên kết và tăng nhiệt độ nóng chảy, tăng cường liên kết đầu dò. Do đó, đầu dò TaqMan MGB có thể ngắn hơn nhiều so với mồi PCR. Do có nửa MGB nên các đầu dò này có thể ngắn hơn đầu dò TaqMan mà vẫn đạt được nhiệt độ nóng chảy cao. Điều này cho phép đầu dò TaqMan MGB liên kết với mục tiêu cụ thể hơn so với mồi ở nhiệt độ cao hơn. Với kích thước đầu dò ngắn hơn, sự không khớp một bazơ có tác động lớn hơn nhiều đến việc liên kết đầu dò TaqMan MGB. Và do mức độ đặc hiệu cao hơn này, nên sử dụng đầu dò TaqMan MGB cho hầu hết các ứng dụng có độ phức tạp di truyền.

 

4. Sản xuất tín hiệu đầu dò TaqMan: 

Cho dù chọn đầu dò MGB hay không MGB thì cả hai đều tuân theo cùng một mẫu để tạo tín hiệu. Trong các chu kỳ PCR đầu tiên, chỉ phát hiện được tín hiệu báo cáo đã tắt và ở mức thấp. Dữ liệu ban đầu này, được tự động trừ về 0 trong phần mềm PCR thời gian thực, được gọi là “đường cơ sở (baseline)”. Nếu mẫu chứa mục tiêu thì cuối cùng, đầu dò phân tách tích lũy đủ sẽ được tạo ra để cho phép tín hiệu khuếch đại xuất hiện từ đường cơ sở. Điểm mà tại đó tín hiệu khuếch đại hiển thị có liên quan nghịch với lượng mục tiêu ban đầu. 

 

5. Thuốc nhuộm SYBR GREEN:

Thuốc nhuộm SYBR Green I là thuốc nhuộm liên kết DNA huỳnh quang, liên kết với rãnh nhỏ của bất kỳ chuỗi DNA kép nào. Sự kích thích thuốc nhuộm SYBR Green gắn DNA tạo ra tín hiệu huỳnh quang mạnh hơn nhiều so với thuốc nhuộm không liên kết. Xét nghiệm dựa trên thuốc nhuộm SYBR Green thường bao gồm hai mồi PCR. Trong điều kiện lý tưởng, xét nghiệm SYBR Green tuân theo kiểu khuếch đại tương tự như xét nghiệm dựa trên đầu dò TaqMan. Trong các chu kỳ PCR đầu tiên, đường cơ sở theo chiều ngang được quan sát thấy. Nếu mục tiêu có mặt trong mẫu, sản phẩm PCR tích lũy đủ sẽ được tạo ra tại một thời điểm nào đó để tín hiệu khuếch đại trở nên rõ ràng

 

Độ đặc hiệu của xét nghiệm SYBR Green 

Kiểm tra độ đặc hiệu của xét nghiệm rất quan trọng đối với tất cả các xét nghiệm, nhưng đặc biệt đối với những xét nghiệm dễ gặp phải các vấn đề về độ đặc hiệu nhất. Các xét nghiệm SYBR Green không được hưởng lợi từ tính đặc hiệu của đầu dò TaqMan, khiến chúng dễ gặp phải các vấn đề về tính đặc hiệu hơn. Thuốc nhuộm màu xanh lá cây SYBR sẽ liên kết với bất kỳ sản phẩm khuếch đại nào, mục tiêu hoặc không phải mục tiêu và tất cả các tín hiệu đó được tổng hợp, tạo ra một biểu đồ khuếch đại duy nhất. Không thể sử dụng hình dạng biểu đồ khuếch đại SYBR Green để đánh giá độ đặc hiệu. Các ô thường có hình thức giống nhau, cho dù phần khuếch đại bao gồm mục tiêu, không phải mục tiêu hay hỗn hợp. Thực tế là xét nghiệm SYBR Green tạo ra sự khuếch đại không được tự động coi là phần lớn bất kỳ tín hiệu nào đều có nguồn gốc từ mục tiêu. Vì sự khuếch đại của chất không phải mục tiêu có thể khác nhau giữa các mẫu, nên ít nhất một loại đánh giá độ đặc hiệu phải được thực hiện cho mỗi phản ứng SYBR Green. Thông thường nhất, đánh giá liên tục này là phân tích phân ly.

 

Phân ly SYBR GREEN:

Sự phân ly SYBR Green là sự tan chảy dần dần của các sản phẩm PCR sau PCR sử dụng SYBR Green. Phân ly là một lựa chọn hấp dẫn để đánh giá tính đặc hiệu vì nó không làm tăng thêm chi phí cho thí nghiệm và có thể được thực hiện ngay trong bình phản ứng PCR. Tuy nhiên, sự phân ly làm tăng thêm thời gian cho quy trình nhiệt, yêu cầu thêm thời gian phân tích, mang tính chủ quan và có độ phân giải hạn chế.

Khái niệm phân ly SYBR® Green là nếu mục tiêu là một trình tự di truyền xác định thì nó phải có một nhiệt độ nóng chảy cụ thể (Tm), nhiệt độ này được sử dụng để giúp xác định mục tiêu trong các mẫu. Một số sản phẩm không phải mục tiêu sẽ có Tms khác biệt đáng kể so với sản phẩm mục tiêu, cho phép phát hiện các mức khuếch đại không phải mục tiêu đó. Giao thức phân ly được thêm vào sau chu kỳ PCR cuối cùng.

Sau quá trình tan chảy, phần mềm Real-time PCR sẽ vẽ đồ thị dữ liệu dưới dạng đạo hàm bậc nhất âm, biến cấu hình tan chảy thành đỉnh.

Việc xác định chính xác đỉnh mục tiêu phụ thuộc vào độ khuếch đại của mục tiêu thuần túy. Nhiều mẫu như RNA tế bào và DNA bộ gen biểu hiện độ phức tạp di truyền cao, tạo cơ hội cho quá trình khuếch đại không phải mục tiêu mà có thể ngăn chặn sự khuếch đại của mục tiêu hoặc trong một số trường hợp, làm thay đổi hình dạng của đỉnh tan chảy. Bằng cách bắt đầu với mục tiêu thuần túy, nhà nghiên cứu sẽ có thể liên kết đỉnh Tm và hình dạng với mục tiêu cụ thể sau khi khuếch đại. Chỉ nên quan sát một đỉnh. Đỉnh mục tiêu giả định phải hẹp, đối xứng và không có các điểm bất thường khác, chẳng hạn như vai, bướu hoặc vết tách. Những bất thường này là dấu hiệu mạnh mẽ cho thấy nhiều sản phẩm có Tms tương tự đã được tạo ra, gây ra những nghi ngờ mạnh mẽ về tính đặc hiệu của những phản ứng đó. Những giếng có dị thường phân ly nên được loại bỏ khỏi phân tích sâu hơn.

Sự phân ly SYBR GREEN có độ phân giải thấp và có thể không phân biệt giữa mục tiêu và không phải mục tiêu với các Tms tương tự, ví dụ: tương đồng. Do đó, không nên coi một đỉnh đối xứng hẹp là mục tiêu hoặc một sản phẩm nếu không có thông tin hỗ trợ bổ sung.

 

Dữ liệu phân ly phải được đánh giá cho từng giếng nơi quan sát thấy sự khuếch đại. Nếu mẫu chứa một đỉnh không tương ứng với đỉnh đích thuần túy thì kết luận là mục tiêu đó không được phát hiện trong phản ứng đó. Nếu mẫu chứa đỉnh có vẻ khớp với Tm và hình dạng của đỉnh đích thuần túy thì đích có thể đã khuếch đại trong phản ứng đó. Dữ liệu phân ly riêng lẻ không thể được coi là chính xác, nhưng khi kết hợp với các thông tin khác, chẳng hạn như dữ liệu từ các mẫu âm tính mục tiêu, giải trình tự hoặc gel, có thể mang lại độ tin cậy cao hơn về độ đặc hiệu.

 

6. Thiết bị PCR thời gian thực

Hiện có nhiều mẫu thiết bị PCR thời gian thực khác nhau. Mỗi kiểu máy phải có một nguồn kích thích để kích thích thuốc nhuộm huỳnh quang và một máy dò để phát hiện sự phát xạ huỳnh quang. Ngoài ra, mỗi model phải có máy luân nhiệt. Khối nhiệt có thể được cố định hoặc có thể hoán đổi cho người dùng. Các khối có sẵn để tiếp nhận nhiều loại bình phản ứng PCR: đĩa 48 giếng, đĩa 96 giếng, đĩa 384 giếng, thẻ 384 microwell, đĩa 3072 lỗ, v.v. Tất cả các thiết bị PCR thời gian thực cũng đi kèm với phần mềm thu thập và phân tích dữ liệu.

 

7. Phân biệt thuốc nhuộm

Hầu hết các phản ứng Real-time PCR đều chứa nhiều thuốc nhuộm, ví dụ: một hoặc nhiều thuốc nhuộm reporter, trong một số trường hợp là thuốc nhuộm quencher và rất thường xuyên là thuốc nhuộm tham chiếu thụ động. Nhiều loại thuốc nhuộm trong cùng một giếng có thể được đo độc lập, thông qua sự kết hợp tối ưu của bộ lọc kích thích và phát xạ hoặc thông qua một quy trình gọi là đa thành phần.

Đa thành phần là một phương pháp toán học để đo cường độ thuốc nhuộm đối với từng loại thuốc nhuộm trong phản ứng. Công nghệ đa thành phần mang lại lợi ích là dễ dàng sửa lỗi chỉ định thuốc nhuộm, làm mới hiệu suất quang học theo tiêu chuẩn xuất xưởng mà không cần điều chỉnh phần cứng và cung cấp nguồn thông tin khắc phục sự cố.

 

Nguồn: Handbook Life Technologies.