Tổng quan về qPCR: Các thuật ngữ chính trong phân tích kết quả chạy Real-time PCR
1. Đường cơ sở (Baseline)
Đường cơ sở của phản ứng Real-time PCR đề cập đến mức tín hiệu trong các chu kỳ PCR ban đầu, thường là chu kỳ từ 3 đến 15, trong đó có rất ít thay đổi về tín hiệu huỳnh quang. Tín hiệu mức thấp của đường cơ sở có thể được coi là nền hoặc “nhiễu” của phản ứng.
Đường cơ sở trong Real-time PCR được xác định theo kinh nghiệm cho từng phản ứng, bằng phân tích của người dùng hoặc phân tích tự động của biểu đồ khuếch đại. Đường cơ sở phải được thiết lập cẩn thận để cho phép xác định chính xác chu kỳ ngưỡng (Ct). Việc xác định đường cơ sở phải tính đến đủ chu kỳ để loại bỏ nền được tìm thấy trong các chu kỳ khuếch đại đầu tiên, nhưng không bao gồm các chu kỳ trong đó tín hiệu khuếch đại bắt đầu tăng lên trên nền. Khi so sánh các phản ứng hoặc thử nghiệm Real-time PCR khác nhau, đường cơ sở phải được xác định theo cách giống nhau cho từng phản ứng hoặc thử nghiệm.
Hình: Đường cơ sở của phản ứng Real-time PCR
2. Ngưỡng (threshold):
Ngưỡng của phản ứng Real-time PCR là mức tín hiệu phản ánh mức tăng đáng kể về mặt thống kê so với tín hiệu cơ sở được tính toán. Nó được thiết lập để phân biệt tín hiệu khuếch đại có liên quan với nền. Thông thường, phần mềm thiết bị Real-time PCR sẽ tự động đặt ngưỡng gấp 10 lần độ lệch chuẩn của giá trị huỳnh quang của đường cơ sở. Tuy nhiên, vị trí của ngưỡng có thể được đặt ở bất kỳ điểm nào trong giai đoạn PCR theo cấp số nhân.
3. Ct (ngưỡng chu kỳ):
Chu kỳ ngưỡng (Ct) là số chu kỳ tại đó tín hiệu huỳnh quang của phản ứng vượt qua ngưỡng. Ct được sử dụng để tính toán số lượng bản sao DNA ban đầu, vì giá trị Ct tỷ lệ nghịch với lượng mục tiêu ban đầu. Ví dụ, khi so sánh kết quả Real-time PCR từ các mẫu chứa lượng mục tiêu khác nhau, một mẫu có lượng mục tiêu gấp đôi ban đầu sẽ mang lại Ct sớm hơn một chu kỳ so với mẫu chứa một nửa số bản sao của mục tiêu trước khi khuếch đại. Điều này giả định rằng PCR đang hoạt động với hiệu suất 100% (tức là lượng sản phẩm tăng gấp đôi hoàn hảo trong mỗi chu kỳ) trong cả hai phản ứng. Khi số lượng mẫu giảm, số chu kỳ tại đó mức khuếch đại đáng kể được nhìn thấy sẽ tăng lên.
4. Đường cong tiêu chuẩn (Standard curve)
Có thể sử dụng chuỗi pha loãng nồng độ mẫu đã biết để thiết lập đường chuẩn nhằm xác định lượng ban đầu của mẫu đích trong các mẫu thử nghiệm hoặc để đánh giá hiệu suất phản ứng.
Log của từng nồng độ đã biết trong dãy pha loãng (trục x) được vẽ theo giá trị Ct cho nồng độ đó
(trục y). Từ đường cong chuẩn này, có thể rút ra thông tin về hiệu suất của phản ứng cũng như các thông số phản ứng khác nhau (bao gồm độ dốc, điểm chặn y và hệ số tương quan). Nồng độ được chọn cho đường chuẩn phải bao gồm khoảng nồng độ dự kiến của mục tiêu trong các mẫu thử nghiệm.
Hình: Ví dụ về đường cong chuẩn của dữ liệu Real-time PCR. Đường cong chuẩn hiển thị chu kỳ ngưỡng (Ct) trên trục y và số lượng bắt đầu của RNA hoặc DNA mục tiêu trên trục x. Các giá trị độ dốc, điểm chặn y và hệ số tương quan được sử dụng để cung cấp thông tin về hiệu suất của phản ứng.
5. Hệ số tương quan (R2)
Hệ số tương quan là thước đo mức độ phù hợp của dữ liệu với đường cong tiêu chuẩn. Giá trị R2 phản ánh tính tuyến tính của đường chuẩn. Lý tưởng nhất là R2 = 1, mặc dù 0,999 thường là giá trị tối đa.
6. Điểm chặn Y (Y-intercept)
Điểm chặn y tương ứng với giới hạn lý thuyết của việc phát hiện phản ứng hoặc giá trị Ct dự kiến nếu số lượng bản sao thấp nhất của các phân tử mục tiêu được biểu thị trên trục x dẫn đến sự khuếch đại có ý nghĩa thống kê. Mặc dù về mặt lý thuyết, PCR có khả năng phát hiện một bản sao duy nhất của mục tiêu, số lượng bản sao từ 2–10 thường được chỉ định là mức mục tiêu thấp nhất có thể định lượng một cách đáng tin cậy trong các ứng dụng Real-time PCR. Điều này hạn chế tính hữu ích của giá trị chặn y như một thước đo trực tiếp về độ nhạy. Tuy nhiên, giá trị chặn y có thể hữu ích để so sánh các hệ thống và mục tiêu khuếch đại khác nhau.
7. Giai đoạn hàm mũ (Exponential phase):
Điều quan trọng là định lượng phản ứng Real-time PCR của bạn ở phần đầu của giai đoạn hàm mũ thay vì ở các chu kỳ sau hoặc khi phản ứng đạt đến trạng thái ổn định. Khi bắt đầu giai đoạn hàm mũ, tất cả các thuốc thử vẫn còn dư, DNA polymerase vẫn hoạt động hiệu quả cao và sản phẩm khuếch đại dù hiện diện với số lượng thấp sẽ không cạnh tranh được với khả năng ủ của mồi. Tất cả những điều này góp phần tạo ra dữ liệu chính xác hơn.
8. Độ dốc (Slope):
Độ dốc của pha log-tuyến tính của phản ứng khuếch đại là thước đo hiệu suất phản ứng. Để thu được kết quả chính xác và có thể lặp lại, các phản ứng phải có hiệu suất càng gần 100% càng tốt, tương đương với độ dốc -3,32.
9. Hiệu suất (Efficiency):
Hiệu suất PCR 100% tương ứng với độ dốc -3,32, được xác định theo phương trình sau:
Hiệu suất = 10 (-1/độ dốc) - 1
Lý tưởng nhất là hiệu suất (E) của phản ứng PCR phải là 100%, nghĩa là mẫu sẽ tăng gấp đôi sau mỗi chu kỳ nhiệt trong quá trình khuếch đại theo cấp số nhân. Hiệu suất thực tế có thể cung cấp thông tin có giá trị về phản ứng. Các yếu tố thực nghiệm như độ dài, cấu trúc thứ cấp và hàm lượng GC của bộ khuếch đại có thể ảnh hưởng đến hiệu suất. Các điều kiện khác có thể ảnh hưởng đến hiệu suất là động lực của phản ứng, việc sử dụng nồng độ thuốc thử không tối ưu và chất lượng enzyme, có thể dẫn đến hiệu suất dưới 90%. Sự hiện diện của chất ức chế PCR trong một hoặc nhiều thuốc thử có thể tạo ra hiệu suất lớn hơn 110%. Một phản ứng tốt phải có hiệu suất từ 90% đến 110%, tương ứng với slope từ -3,58 đến -3,10.
10. Dải động (Dynamic range):
Đây là khoảng mà trong đó sự gia tăng nồng độ nguyên liệu ban đầu sẽ dẫn đến sự gia tăng tương ứng của sản phẩm khuếch đại. Lý tưởng nhất, phạm vi động cho Real-time PCR phải là 7-8 bậc độ lớn đối với DNA plasmid và ít nhất là phạm vi log 3-4 đối với cDNA hoặc DNA bộ gen.
11. Định lượng tuyệt đối (Absolute quantification):
Định lượng tuyệt đối mô tả một thí nghiệm Real-time PCR, trong đó các mẫu có số lượng đã biết được pha loãng theo thứ tự và sau đó được khuếch đại để tạo ra đường cong chuẩn.
Các mẫu chưa biết sau đó được định lượng bằng cách so sánh với đường cong này.
12. Định lượng tương đối (Relative quantification):
Định lượng tương đối mô tả một thí nghiệm Real-time PCR trong đó sự biểu hiện của gen quan tâm trong một mẫu (tức là đã được xử lý) được so sánh với biểu hiện của cùng một gen trong một mẫu khác (tức là chưa được xử lý). Các kết quả được biểu thị bằng sự thay đổi lần lượt (tăng hoặc giảm) trong biểu hiện của đối tượng được xử lý so với đối tượng không được xử lý. Một gen chuẩn hóa (chẳng hạn như β-actin) được sử dụng như một chất kiểm soát sự biến đổi thực nghiệm trong loại định lượng này.
13. Đường cong nóng chảy - đường cong phân ly (Melting curve)
Đường cong nóng chảy biểu thị sự thay đổi huỳnh quang quan sát được khi DNA sợi đôi (dsDNA) với các phân tử thuốc nhuộm kết hợp phân tách hoặc “tan chảy” thành DNA sợi đơn (ssDNA) khi nhiệt độ của phản ứng tăng lên. Ví dụ, khi làm nóng DNA sợi đôi liên kết với thuốc nhuộm SYBR Green I, sự giảm huỳnh quang đột ngột được phát hiện khi đạt đến điểm nóng chảy (Tm), do sự phân ly của các chuỗi DNA và sau đó giải phóng thuốc nhuộm. Sự phát huỳnh quang được vẽ theo nhiệt độ (Hình A), và sau đó -ΔF/ΔT (thay đổi huỳnh quang/thay đổi nhiệt độ) được vẽ theo nhiệt độ để có được cái nhìn rõ ràng về động lực nóng chảy (Hình B).
Hình: Đường cong nóng chảy (A) và -ΔF/ΔT so với nhiệt độ (B)
Phân tích đường cong nóng chảy sau khuếch đại là một cách đơn giản, dễ hiểu để kiểm tra các phản ứng Real-time PCR đối với các tạo tác primer-dimer và để đảm bảo tính đặc hiệu của phản ứng. Do nhiệt độ nóng chảy của axit nucleic bị ảnh hưởng bởi độ dài, hàm lượng GC và sự hiện diện của các bazơ không khớp, trong số các yếu tố khác, các sản phẩm PCR khác nhau thường có thể được phân biệt bằng đặc điểm nóng chảy của chúng. Việc xác định đặc tính của các sản phẩm phản ứng (ví dụ: Primerdimer so với Amplicon) thông qua phân tích đường cong nóng chảy giúp giảm nhu cầu điện di trên gel tốn nhiều thời gian.
Hình A: Sơ đồ khuếch đại
Hình A minh họa sơ đồ khuếch đại PCR thời gian thực điển hình. Trong những chu kỳ đầu của phản ứng PCR, tín hiệu huỳnh quang ít thay đổi. Khi phản ứng tiến triển, mức độ huỳnh quang bắt đầu tăng lên theo từng chu kỳ. Ngưỡng phản ứng được đặt trên đường cơ sở trong phần hàm mũ của biểu đồ. Ngưỡng này được sử dụng để ấn định chu kỳ ngưỡng hoặc giá trị Ct của mỗi phản ứng khuếch đại. Giá trị Ct của một loạt phản ứng chứa một lượng mục tiêu đã biết có thể được sử dụng để tạo đường chuẩn. Việc định lượng được thực hiện bằng cách so sánh các giá trị Ct của các mẫu chưa biết với đường cong chuẩn này hoặc trong trường hợp định lượng tương đối, với nhau, với đường cong chuẩn đóng vai trò kiểm tra hiệu quả. Giá trị Ct tỷ lệ nghịch với lượng mẫu ban đầu: lượng mẫu ban đầu trong phản ứng càng cao thì giá trị Ct của phản ứng đó càng thấp.
Hình B: Đường cong tiêu chuẩn hiển thị số lượng bản sao của mẫu so với chu kỳ ngưỡng
Hình B thể hiện đường cong chuẩn được tạo ra từ các giá trị Ct trong biểu đồ khuếch đại. Đường cong chuẩn cung cấp thông tin quan trọng liên quan đến hiệu suất khuếch đại, tính nhất quán tái tạo và giới hạn phát hiện lý thuyết của phản ứng.
Nguồn: Real-time PCR handbook life technologies
